利用金屬鍍膜可視化DNA分子

2019-09-10 14:19:46 admin 212

重金屬(如鉑)的精準小角度旋轉投影可用於透射電子顯微鏡(TEM)成像,以觀察先前被吸附在細小顆粒度、電子束可穿透的碳薄膜上的樣本分子細節。  


為了得到最高的對比度和更好的成像質量,鍍膜必須是方向性的,而且需要和樣品有一個精準的角度。此外,覆蓋樣品表麵的金屬層顆粒精細度和鍍膜材料的厚度均一性,也是獲得高質量TEM圖像的關鍵要求。

奧林巴斯顯微鏡

今天小編給大家介紹的是電子束蒸發在DNA分子可視化中的應用。本文中的實驗方法最初由José Sogo博士在蘇黎世ETH研究所實驗室獲得,改進後由Massimo Lopes教授在蘇黎世大學IMCR研究所得以推廣[1]。由於該方法在2018年又進行了優化[1],因此,給大家簡要介紹其最新關鍵步驟,以及生物科學家如何使用徠卡EM ACE600高真空鍍膜儀獲得高質量實驗結果

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圖1. 徠卡高真空鍍膜儀EM ACE600


小角度旋轉投影

徠卡新一代EM ACE600(圖1)可產生均勻、非常薄且顆粒度小的電子可穿透性碳層,因此可用於吸附生物樣本(如DNA分子、蛋白質或DNA-蛋白質複合物)。然後使用精確且可再現的投影角度將單個分子或吸覆在碳膜上的大分子複合物投影,從而產生高對比度TEM圖像。

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圖2. 科學家和EM ACE600



實驗中的關鍵步驟、DNA樣品的準備

該方法適用於已經純化好的、不含蛋白質和RNA分子的DNA樣品,可以基於DNA鏈的不同厚度來區分雙鏈DNA(dsDNA)和單鏈DNA(ssDNA)。

 第一步  DNA分子在甲酰胺,乙二醛和去垢劑苄基-二甲基-烷基-氯化銨(BAC)中形成穩定溶液。這種混合物通過特定的擴散方式散布在水表麵上,DNA分子形成單分子層膜。

 第二步  用400目TEM銅網接觸水麵上的DNA單分子層膜,在該銅網表麵形成均勻、低顆粒度的薄層(4-8nm)。然後將其立即浸入乙醇和乙酸雙氧鈾溶液中。

 第三步  對吸覆DNA分子的銅網進行精準的小角度旋轉投影,鍍鉑8nm。這種負染對於dsDNA鏈的可視化特別有效。

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圖3. EM ACE600高真空樣品倉和傾斜式雙鍍膜靶源



如何利用EM ACE600製備高質量的碳膜層?

高質量的碳膜和精確的小角度旋轉鉑金投影的結合才能產生高質量的DNA鏈的TEM圖像。使用EM ACE600高真空鍍膜儀在V2高級雲母片上產生碳膜,然後將其漂浮在水的表麵上,最後在上麵放置400目銅裸網,無額外的方華膜和支撐材料,這種方法產生的碳膜高效吸收DNA分子,並且不需要輝光放電(glow discharge)。


如何利用EM ACE600進行小角度旋轉投影的鍍鉑?

400目銅網表麵吸附的DNA分子,需要進行精準的小角度旋轉投影。借助ACE600,8 nm鉑膜製備將十分簡單,隻需將銅網固定在EM ACE600的GRID台子上(圖3),運行EM ACE600兩個不同的程序即可。


 1  在碳網表麵上噴鍍0.4 nm的鉑金層,此過程鍍膜夾角為1°且不旋轉GRID台子;


 2  同樣以1°夾角鍍膜7.6 nm的鉑層,但將GRID台子的旋轉速度設定為1級。


結果優化須知

將蒸發參數(主要是蒸發速度)設定為在恒定值(0.03-0.08 nm/s)以保持合適的蒸發速度,對於形成理想碳膜厚度和小角度旋轉投影非常重要。為了得到高質量的細顆粒金屬層,電子槍和蒸發室必須保持極其清潔。

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圖4. EM ACE600觸控屏交互方式



新一代高真空鍍膜儀優點

與上一代MED蒸發鍍膜儀相比,新一代徠卡EM ACE600高真空鍍膜儀具有眾多優點


鍍膜儀采用優化的設計和堅固的硬件,使其具有良好的操作性和結果穩定性電子槍的改進和新式電子控製係統可以讓用戶在觸控屏上查看、設置所有參數。此外,EM ACE600還具有安全警報功能,如果張力和電流超過一定值,則不會產生電子蒸發,這有助於用戶的安全操作和設備的自我保護,獲得可靠結果同時延長設備使用壽命。


DNA分子(寬度約2.2-2.4 nm)的可視化,要求非常精準且可再現的投影角度,因此對鍍膜儀的要求很高!


新一代徠卡EM ACE600采用參數可視化和精準控製的交互方式(圖4),允許用戶無需具備深厚相關工作經驗和大量預實驗,甚至可以直接調用其他用戶已保存的單個或整個操作參數,即可完成意想不到的實驗結果!



結果

使用BAC、醋酸鈾染色和EM ACE600製備的小角度旋轉投影可視化溶液中質粒DNA分子的TEM圖像(圖5)。這些圖像表明,該方法可以有效可視化、區分ssDNA和dsDNA。

比例尺(大約相當於1 kb DNA長度)。紅色箭頭表示質粒複製區域。dsDNA厚度約為20 Å (1 Å = 1x10-10 m= 0.1 nm)。在該實驗條件下,0.36 nm大致對應於1 bp的dsDNA。該結果使用某品牌透射電子顯微鏡,在80 KV下成像。

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圖5a. 使用EM ACE600鍍膜儀可視化溶液中質粒DNA分子的TEM圖像。成像條件如上述


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圖5b. 使用EM ACE600鍍膜儀可視化溶液中質粒DNA分子的TEM圖像。成像條件如上述


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圖5c.含複製叉的DNA TEM照片,DNA提取自芽殖酵母S.cerevisiae。

比例尺(大約相當於1 kb DNA長度),成像條件如上述


參考文獻

[1] Zellweger R., Lopes M..  Dynamic Architecture of Eukaryotic DNA Replication Forks In Vivo, Visualized by Electron Microscopy. Methods Mol Biol. 2018;1672:261-294. doi: 10.1007/978-1-4939-7306-4_19

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29043630


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